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廣州昱杰生物科技，以“科學(xué)家的問題解決者”為愿景，代理產(chǎn)品涉及分子、影像、細胞、生物、數(shù)字病理等多個專業(yè)領(lǐng)域，代理品牌包括：PerkinElmer、 ThermoFisher（ABI熒光定量PCR儀）、 Cytek、 IndicaLabs、 Olink、江蘇卓微JIMBIO、廈門福流 Nano FCM、江豐生物 KFBio、佰諾全景 PanoVUE、天根生化、富士 Visualsonics等多家國際知名生命科學(xué)相關(guān)品牌。

突破空間組學(xué)研究極限：Visium HD 與 Xenium In Situ 的完美融合

Visium HD和Xenium原位分析

新型的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)工具將傳統(tǒng)成像與分子分析融為一體，讓您更全面地了解感興趣的生物學(xué)特征。無論您是揭示神經(jīng)系統(tǒng)復(fù)雜性的神經(jīng)科學(xué)家，還是深入解析腫瘤微環(huán)境的轉(zhuǎn)化研究人員，抑或是嘗試回答各種其他問題的科學(xué)家，空間維度的見解都能為您的研究項目打開新的大門。

互補的空間工具：

Visium HD和Xenium原位分析

Visium HD是一種基于測序的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，它采用基于探針的化學(xué)方法進行空間背景下的全轉(zhuǎn)錄組分析。將探針與靶點雜交，再與標(biāo)準(zhǔn)載玻片上的組織相連接。洗掉未結(jié)合的探針，然后通過CytAssist將結(jié)合的探針精確轉(zhuǎn)移到Visium HD玻片上（這個關(guān)鍵步驟可通過最大限度減少擴散來提高空間保真度）。然后利用這些探針生成帶有空間條形碼的NGS文庫，以便生成測序讀數(shù)。

Xenium是一種基于成像的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，使用了靶向預(yù)選基因的鎖式探針。與目標(biāo)基因雜交后，探針通過連接而環(huán)化（為靶點特異性增添了一層可信度），并在滾環(huán)反應(yīng)中擴增。之后在Xenium分析儀上，通過多輪熒光探針雜交、組織成像和探針去除對擴增產(chǎn)物進行檢測，產(chǎn)生基于成像的讀數(shù)。

Ayako Suzuki博士正是這么做的。根據(jù)她最近發(fā)表在《Nature Communications》上的文獻（5），她首先使用Visium v2來確定肺部腫瘤中的基因表達變化發(fā)生在哪些位置，然后用Xenium來放大，精確定位與腫瘤亞型中的肺泡塌陷相關(guān)的特定細胞和細胞類型。

技術(shù)規(guī)格比較

關(guān)于多重分析：

全轉(zhuǎn)錄組、靶向分析和定制選項

多重分析：單次分析可測定多少種RNA（基因、外源基因、同源異構(gòu)體等）。

每個平臺達到的轉(zhuǎn)錄本覆蓋廣度和深度各不相同。為了提供廣泛的覆蓋，Visium HD能夠無偏地覆蓋整個轉(zhuǎn)錄組（約20,000個基因）。再結(jié)合為其他感興趣的靶點設(shè)計定制探針的能力，Visium HD具有無以倫比的空間發(fā)現(xiàn)能力，能夠表征廣泛的組織，從頭鑒定感興趣的區(qū)域或細胞類型。

同時，Xenium通過多達480個基因的基因組合帶來了靶向分析功能（2024年即將推出的Xenium 5K人類和小鼠基因組合將擴展到5,000個基因）。這些預(yù)設(shè)計的基因組合有多種配置，帶有組織或應(yīng)用特異性的靶點，最多可定制添加100個目標(biāo)基因。

多重分析比較

表征靈敏度：

單基因靈敏度、基因檢測范圍和轉(zhuǎn)錄本豐度

靈敏度：定義檢測轉(zhuǎn)錄本的效果如何。盡管在空間技術(shù)領(lǐng)域被廣泛使用，但可以細分為：單基因靈敏度、基因檢測范圍和轉(zhuǎn)錄本豐度。使用哪個術(shù)語取決于作者想要強調(diào)哪個具體方面的性能。

單基因檢測靈敏度

分析能夠檢測到的每個基因的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量。這個指標(biāo)在分析差異基因表達和檢測稀有轉(zhuǎn)錄本、同源異構(gòu)體和基因變異等應(yīng)用中至關(guān)重要。再結(jié)合基因檢測范圍，這個指標(biāo)有助于確定分析的動態(tài)范圍。

基因檢測范圍

您能夠在每個細胞或組織區(qū)域內(nèi)檢測到多少種不同的轉(zhuǎn)錄本，具體取決于單基因靈敏度、多重分析和組織類型。在以發(fā)現(xiàn)為重點的應(yīng)用中，基因檢測范圍特別重要，例如表征健康或疾病狀態(tài)下的感興趣組織。

轉(zhuǎn)錄本豐度

每個細胞或組織區(qū)域內(nèi)可檢測到的轉(zhuǎn)錄本總數(shù)。這個指標(biāo)可用來確定整體基因表達的大范圍變化。根據(jù)分析方法的單基因靈敏度、基因檢測范圍、多重分析以及分析的組織總面積計算得出。

那么Xenium和Visium的靈敏度相比之下如何呢？盡管Xenium和Visium HD的直接比較數(shù)據(jù)正在生成當(dāng)中，但我們最近在《Nature Communications》雜志上發(fā)表了一篇論文，對Xenium和“標(biāo)準(zhǔn)清晰度的”Visium v2在連續(xù)組織切片上的靈敏度進行了比較。

在這個特定實驗和樣本中，Xenium的單基因靈敏度高于Visium v2，而Visium v2的基因檢測范圍和轉(zhuǎn)錄本豐度均高于Xenium。這在很大程度上是由于Visium捕獲了整個轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，而Xenium則采用了更加靶向的方法。此外，我們還注意到，在某些組織類型（但不是全部）中，以高于我們推薦的深度進行測序會導(dǎo)致單基因靈敏度顯著升高。因此，在某些組織或樣本中，轉(zhuǎn)錄本豐度和單基因靈敏度會隨著測序深度而有所調(diào)整。

靈敏度比較

選擇分辨率：

如何分配轉(zhuǎn)錄本以及如何精細地分配？

分辨率：包括將轉(zhuǎn)錄本分配到定義的組織區(qū)域或細胞中的哪個位置，以及觀察它們的最精細程度。

Visium HD中的轉(zhuǎn)錄本被分配到一個小到足以捕獲單細胞的區(qū)域。具體來說，利用CytAssist儀器將結(jié)合的探針精確轉(zhuǎn)移至捕獲區(qū)域，其中寡核苷酸連續(xù)排列在數(shù)百萬個2 x 2 μm條形碼標(biāo)記的正方形中。然后以2 x 2 μm正方形單位以及多個合并單位輸出這種基于空間條形碼的測序讀數(shù)（包括8 x 8 μm合并單位，這是我們推薦的分析起點）（圖1A）。

由于這些正方形單位小到足以捕獲單細胞，這種方法能表征每個單位中存在的主要細胞類型。考慮到這種合并策略和真核細胞的平均大小（介于10到100 μm），每個合并區(qū)域可能覆蓋不止一個細胞的組分；因此，Visium HD帶來了我們所說的單細胞分辨率（圖1B）。第三方工具可幫助您對Visium HD數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)點解卷積。

圖1A. Visium HD的捕獲區(qū)域結(jié)構(gòu)。這張示意圖展示了Visium HD玻片的布局，帶有兩個6.5 x 6.5 mm的Visium HD捕獲區(qū)域，其中捕獲寡核苷酸連續(xù)排列在細分為2 x 2 μm的正方形單位內(nèi)。

圖1B. 對H&E染色后的人類結(jié)腸癌組織的Visium HD分析，轉(zhuǎn)錄本被分配到8 x 8 μm的合并單位內(nèi)。圖中展示了帶有無監(jiān)督基因表達聚類的人類結(jié)腸癌縮小圖像（左圖），以及8 x 8 μm單位內(nèi)的基因表達聚類放大圖像（右上圖）和H&E染色組織放大圖像（右下圖）。Visium HD能夠分辨2 x 2 μm正方形內(nèi)的轉(zhuǎn)錄本，但我們建議以8 x 8 μm的合并單位作為起點進行可視化和分析。

Xenium原位分析將轉(zhuǎn)錄本分配到單個細胞中（圖2）。在Xenium運行過程中，組織中的每條轉(zhuǎn)錄本會被分配X-Y-Z軸坐標(biāo)。之后，在儀器運行過程中進行多模態(tài)細胞分割，利用各種形態(tài)學(xué)染料和專門的人工智能算法來確定各個細胞的邊界。根據(jù)這些邊界及其空間坐標(biāo)將每條轉(zhuǎn)錄本分配給單個細胞，精度達到納米級（XY軸定位精度 < 30 nm，Z軸定位精度 < 100 nm）。

圖2. 利用Xenium Explorer對人類肺腺癌進行分析。上圖顯示的是人類肺腺癌切片的圖像，下圖顯示了Xenium Explorer放大后的圖像，圖中展示了分割的細胞以及定位在單個細胞內(nèi)的與免疫細胞類型相關(guān)的選定轉(zhuǎn)錄本。

分辨率比較

超越基因表達：

利用多組學(xué)功能獲取更多信息

多組學(xué)分析：除了RNA之外，您可以測定的全套分析物，比如形態(tài)、蛋白質(zhì)等。

Visium HD和Xenium都能評估同一張切片的形態(tài)（H&E染色）、蛋白質(zhì)（免疫熒光IF染色）和RNA數(shù)據(jù)。在撰寫本文時，Visium HD可在單張切片上進行H&E或IF染色，而Xenium可進行兩種染色。

對于Visium HD分析，H&E或IF染色是在工作流程開始前進行的，這讓您能夠在Visium流程之前利用成像數(shù)據(jù)篩選組織切片。

對于Xenium，H&E和IF染色在Xenium工作流程結(jié)束后進行。客戶還可以利用Xenium化學(xué)方法的非破壞性特點，在Xenium流程結(jié)束后對同一張切片進行Visium分析（我們正在定量Xenium分析對Visium HD的分析性能有何影響，如果有的話）。最后，我們預(yù)計在2024年晚些時候推出適用于Xenium平臺的< 30重集成蛋白質(zhì)組學(xué)解決方案。

從理論思考到實際問題：

組織類型、樣本形式和經(jīng)費考量等

在試圖將新技術(shù)整合到您的實驗室中時，實用性是關(guān)鍵的因素。在這一部分，我們將分析一些重要的考慮因素，如組織類型、樣本形式、數(shù)據(jù)分析方法和儀器使用。

組織固定、兼容物種和組織形式

組織是整個實驗的基礎(chǔ)，而兩個因素將決定分析的進程——組織是否固定以及它來源于哪個物種。

Xenium和Visium HD分析都與福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織兼容，而Xenium還與新鮮冷凍組織兼容。我們計劃在近期發(fā)布一套利用Visium HD分析新鮮冷凍組織的示范方案。

在物種兼容性方面，Visium HD可以對人類和小鼠進行全轉(zhuǎn)錄組分析。如果您有意向分析非人類靈長動物或大鼠組織，請發(fā)郵件至support@10xgenomics.com，我們也許能提供您的物種與人類和小鼠探針組的同源性報告。對于Xenium分析，我們提供了人類和小鼠的預(yù)設(shè)計且可定制的基因組合。此外，Xenium分析也兼容其他物種，您可以通過高級定制設(shè)計流程（6）來創(chuàng)建基因組合，分析帶有轉(zhuǎn)錄組注釋的任何物種。

組織形式也是一個重要的考慮因素。Visium CytAssist儀器允許您使用存檔或預(yù)先切片的載玻片，以及從FFPE組織塊中專門新鮮制備的載玻片。Xenium則要求在Xenium載玻片上直接進行組織切片。

如果您的組織是FFPE組織，來源于人類或小鼠，那么與任一平臺兼容。Xenium分析也與新鮮冷凍組織兼容，在即將發(fā)布的示范方案中，這一功能將擴展到Visium HD。如果您研究的物種既非人類又非小鼠，Xenium可通過高級定制設(shè)計選項與任何物種兼容，而Visium HD可能與非人類靈長動物或大鼠兼容（取決于客戶支持指南）。

樣本數(shù)量、組織大小和時間限制

對于任何技術(shù)而言，樣本越多，耗時越長。然而，這一普遍規(guī)律有兩個主要差別。首先，額外花費的時間并不一定因每個額外樣本呈線性增加。其次，組織樣本在捕獲區(qū)（Visium HD）或成像區(qū)（Xenium）的排列方式多種多樣——一張載玻片可以容納一個大樣本、幾個中等樣本或多個小樣本（圖3）。考慮到這一差別，從運行的玻片數(shù)量（而非嚴(yán)格意義上的分析樣本數(shù)）來考慮這些技術(shù)可能會有所幫助。

圖3. Visium HD和Xenium載玻片上的組織放置方式示例。Visium HD（上圖）或Xenium（下圖）的單次運行可根據(jù)各種不同的組織配置來優(yōu)化，包括（但不限于）單塊大切片和組織芯片，具體取決于實驗的需求。

作為一種基于NGS的技術(shù)，每次Visium HD運行的輸出結(jié)果是一個測序文庫。這樣您就能在單次NGS運行中批量處理大量樣本。因此，在Visium分析時，您能夠通過批量處理大量樣本的測序文庫來擴大規(guī)模。Visium HD工作流程本身大約需要2-3天，其中手動操作約8小時，并且可根據(jù)樣本、人員、熱循環(huán)儀和CytAssist儀器的可用性進行并行處理。

Xenium是一種基于成像的技術(shù)，而單細胞空間成像實驗中最耗時的部分就是成像。盡管我們已經(jīng)竭盡全力來優(yōu)化這些步驟，但每次Xenium運行都需要自己的圖像采集和分析，這與基于NGS的Visium HD工作流程中的測序步驟最為相似。

對基于成像的Xenium來說，組織分析時間和通量隨分析的組織總面積和分析多重性而定。在利用480重基因組合分析總面積為4 cm2 的組織（使用多模態(tài)細胞分割）時，我們預(yù)計手動操作時間為6小時，圖像采集前的準(zhǔn)備時間為2-3天，這些操作可并行開展，取決于樣本、人員和擴增儀器的可用性。基于這些參數(shù)，圖像采集和分析可能需要長達3天的時間，不過您可以選擇分析組織上的部分區(qū)域來縮短運行時間。

數(shù)據(jù)分析方法

Xenium原位分析和Visium HD分析的數(shù)據(jù)最終分別以基于成像和測序的形式輸出。兩個平臺都提供了直觀的數(shù)據(jù)可視化和分析流程，并與第三方工具輕松兼容，讓您能夠充分利用數(shù)據(jù)。

在Visium文庫測序完成后，通過Space Ranger分析流程運行數(shù)據(jù)。這些輸出結(jié)果（包括但不限于特征條形碼矩陣（h5）和組織位置（parquet）等文件格式）可通過Loupe Browser進行可視化，并對Visium聚類進行差異分析和再聚類（圖4）。

圖4. Loupe Browser中的Visium HD數(shù)據(jù)可視化示例。可視化結(jié)果呈現(xiàn)了E17小鼠胚胎中轉(zhuǎn)錄本的表達分布。

Xenium數(shù)據(jù)的機載分析與圖像采集和分析步驟同步進行，因此在運行結(jié)束后會立即生成可解釋的數(shù)據(jù)，具體格式包括ome.tiff（圖像）、.parquet、.zarr和.csv（轉(zhuǎn)錄本）。這些輸出結(jié)果可通過Xenium Explorer進行可視化（圖5）。

圖5. Xenium Explorer中的Xenium數(shù)據(jù)可視化范例。可視化結(jié)果呈現(xiàn)了利用Xenium人類多種組織和癌癥基因組合分析的FFPE人類肺癌組織。

Xenium和Visium HD都特有全面整合且直觀的數(shù)據(jù)可視化和分析流程、多種開放格式的文件輸出以及與第三方分析工具的輕松兼容。

如果您想了解visium HD 和Xenium，歡迎您聯(lián)系我們！

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